Kronik böbrek hastalığı olan sıçanlarda adipöz kökenli stromal vasküler franksiyonun ve trombositten zengin plazmanın kemik iyileşmesi üzerine etkileri

Abstract

Günümüzde Dünya nüfusunun %10 kadarında herhangi bir seviyede böbrek hastalığına bağlı problemler gözlenmektedir. Kronik böbrek hastalığının (KBH) osteoblast/osteoklast dengesinin bozulması ve mineralizasyonun azalması gibi mekanizmalar ile kemik yapısını bozduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, kronik böbrek hastalığı olan sıçanlarda yağ hücresi kökenli kök hücreden zengin stromal vasküler fraksiyonun (SVF) ve trombositten zengin plazmanın (TZP) kemik iyileşmesi üzerine etkisinin araştırılması amaçlandı. Çalışmada kullanılan 62 adet Sprague- Dawley cinsi erkek sıçan, Grup I (n:12), Grup II (n:12), Grup III (n:12) ve Grup IV (n:16) olmak üzere dört gruba ayrıldı. 10 sıçan SVF ve TZP eldesi için kullanıldı. Sağlıklı kontrol grubu olarak kullanılan Grup I hariç diğer gruplara KBH oluşturmak için cerrahi olarak 5/6 nefrektomi modeli uygulandı. Gruplardaki tüm sıçanların sol femurlarına tur motoru ile kırık oluşturulmasını takiben intramedüller kemik fiksasyonu uygulandı. Grup II sıçanlar KBH kontrol grubu olarak takip edildi. Grup III sıçanların kemik kırığı bölgesine kalsiyum ile jelleştirilmiş TZP verildi. Grup IV sıçanlarının kemik kırığı bölgesine TZP ve SVF tedavisi uygulandı. Sıçanların KBH tanısı ve takibine yönelik, 3 haftalık aralık ile ağırlık ölçümü yapıldı ve 0. gün, 3, 6 ve 12. haftada sıçanların kan hemoglobin, üre ve kreatinin seviyeleri ölçüldü. Kandan kemik iyileşmesi parametreleri olan parathormon, D vitamini ve kalsiyum alınarak kemik kırığı oluşturulması öncesi ve sonrası olarak karşılaştırıldı. Kemik iyileşmesi ve kallus oluşumu; biyomekanik olarak üç nokta bükme testi, radyolojik olarak bilgisayarlı tomografi ve direkt grafi, histopatolojik olarak ve immun boya olan osteokalsin ile değerlendirildi. Kök hücrelerin osteoblastik dönüşümü immunfloresan mikroskopunda DiI boyaması ile gösterilmesi amaçlandı. Grup II, III ve IV de bulunan KBH’li sıçanların ağırlık değişimi istatistiksel olarak anlamlı olarak bulundu. Morfolojik olarak kallus dokusu miktarı ve kemiğin düzgün iyileşme bulguları sırası ile: Grup IV> GrupIII> Grup I> Grup II olarak gözlendi. Kemiklerin mekanik dayanıklılıkları sırası ile: Grup IV> GrupIII> Grup I> Grup II olarak ölçüldü. Kemik iyileşmesinin radyolojik değerlendirilmesi rakamsal değeri arttıkça iyileşmeyi gösteren modifiye Lane ve Sandru skorlama sistemine göre yapıldı. Skorlama sonuçları: 3.91 ±0.64 (Grup I), 3.5 ±0.64 (Grup II), 5.08 ±1.44 (Grup III), 5.43 ±0.99 (Grup IV) olarak bulundu. Kortikal kemik iyileşme bölgesinden, kallusun en dış noktasına olan kalınlıklarının ölçülmesi sonucu ortalama kallus kalınlıkları; 2.16 ±0.51 (Grup I), 1.75 ±0.50 (Grup II), 2.90 ±0.26 (Grup III), 3.23 ±041 (Grup IV) olarak ölçüldü. Kemik iyileşmesi skorlama sistemi sonuçları ile ölçülen kallus kalınlıklarının karşılaştırılmasında; skorlama sistemi ile kallus kalınlıkları arasında anlamlı korelasyon gözlendi. 0. gün, 3. hafta, 6. hafta ve 12. haftada alınan kan örneklerinde BUN, kreatinin seviyelerinde yükselme ve hemoglobin seviyelerindeki düşme anlamlı bulundu. Tüm denek gruplarında kan kalsiyum, PTH ve D vitamini sonuçlarında düşüş gözlendi. KBH’lı gruplardaki sıçanlarda kırık öncesi benzer kemik iyileşmesi parametreleri gözükmekte iken uygulanan TZP ve SVF tedavileri sonrası vitamin ve minerallerdeki azalma daha az oldu. Histopatolojik değerlendirmede kemik dokunun iyileşme skorlaması (Allen skorlaması) sonuçları 4.71±0.99 (Grup I), 4.17 ±0.62 (Grup II), 5.17 ±0.90 (Grup III), 5.38 ±0.88 (Grup IV) olarak bulundu. Kemik dokunun mineralizasyon miktarları 1.43 ±0.49 (Grup I), 1.33 ±0.47 (Grup II), 1.50 ±0.50 (Grup III), 1.68 ±0.49 (Grup IV) olarak bulundu. Kemik dokunun immunohistokimyasal incelenmesinde osteokalsin ile boyanma yoğunluklarına göre 1.43 ±0.49 (Grup I), 1.33 ±0.47 (Grup II), 2.17 ±0.37 (Grup III), 2.38 ±0.49 (Grup IV) olarak bulundu. Kemik hücrelerine özel immünolojik boya olan osteokalsin ile boyalı preparatlar aynı kesitlerin DiI boyaması ile karşılaştırıldı. Adipoz kaynaklı kök hücrelerin kemik hücresine dönüşüm gösterildi. Çalışmamızda kronik böbrek hastalığının kemik iyileşmesine olan olumsuz etkilerinin TZP ve SVF tedavileri ile mekanik, histolojik, radyolojik ve biyokimyasal olarak daha olumlu parametreler elde edilebileceği gösterildi. Kemik kırığı sonrası oluşan kallus dokusunun kalınlığı kemik dokunun iyileşme sürecini uzatsa da geç dönemde daha sağlam kemik oluşumuna öncül olacağı gösterildi. KBH hastalarında kemik iyileşmesinin hızlandırılması ve regüle edilmesi amacı ile mezenkimal kök hücre uygulanması sonrası hayvan çalışmalarında elde edilen olumlu sonuçların klinik uygulamada benzer etkileri gösterebileceği düşüncesindeyiz. Present studies show that %10 of the world population have problems related to kidney disease at any level. It is known that chronic kidney disease (CKD) impairs osteoblast/ osteoclast balance and damages bone structure with mechanisms such as diminished mineralization. In this study; we aim to investigate the effects of adipose derived stromal vascular fraction (SVF) and platelet-rich plasma (PRP) on bone healing model in rats with chronic renal failure. In this study; 62 male Sprague- Dawley rats were used and seperated into four groups as, Group I (n:12), Group II (n:12), Group III (n:12), Group IV (n:16). 10 rats were used for harvesting SVF and PRP. All groups except Group I, which was used as healthy control group, had CKD surgery using 5/6 nephrectomy operation. Both groups had intramedullary pin fixation after receiving bone fracture on their left femur with the help of drilling tools. Group II rats were used as control group for CKD. Group III rats received PRP treatment on fracture site. Group IV rats received PRP and SVF treatment on fracture site. Rats were diagnosed and followed as CKD with weight loss parameters and hemoglobin, urea and creatinine measurements are made at the beginning, 3rd, 6th and 12th weeks. Parathormone, vitamin D and calcium levels are measured before and after bone fracture for bone healing parameters. Bone healing and amount of callus formation is compared; biomechanically with three point bending test, radiologically with computed tomography and X-ray graphy, histopathologically and immunohistochemically with osteocalcine staining. Osteoblastic transformation of stem cells were assessed with DiI staining under immunoflorescent microscope. Group II, III ve IV rats with CKD had statistically significant weight loss. Morphological examination of callus formation and bone healing finding were as GroupIV> Group III> Group I> Group II. Biomechanical properties and resistance of bone tissue was measured as Group IV> Group III> Group I> Group II. Radiological findings are evaluated using modified Lane and Sandru scoring system which is a numerical scoring system that shows improvement as the score increases were resulted as; 3.91 ±0.64 (Group I), 3.5 ±0.64 (Group II), 5.08 ±1.44 (Group III), 5.43 ±0.99 (Group IV). The distance between cortical bone healing zone and outer margin of callus formation is measured as; 2.16 ±0.51 (Group I), 1.75 ±0.50 (Group II), 2.90 ±0.26 (Group III), 3.23 ±041 (Group IV). There was a correlation between results of bone healing scoring system and thickness of callus formation. Blood samples that were taken on first day, 3rd, 6th and 12th weeks show significant increase in plasma urea level and creatine and decrease in hemoglobin levels. All groups had decrease in calcium, parathormone and vitamin D levels. Rats with CKD had similar bone healing parameters comparing before bone fracture and after SVF and PRP treatment; decrease in vitamin and mineral levels had lower rate of decrease. Histopathologic evaluation was made using Allens scoring system which was resulted as; 4.71±0.99 (Group I), 4.17 ±0.62 (Group II), 5.17 ±0.90 (Group III), 5.38 ±0.88 (Group IV). Amount of bone mineralization was found as; 1.43 ±0.49 (Group I), 1.33 ±0.47 (Group II), 1.50 ±0.50 (Group III), 1.68 ±0.49 (Group IV). İmmunuhistochemical evaluation of bone tissue with osteocalcin staining resulted as; 1.43 ±0.49 (Group I), 1.33 ±0.47 (Group II), 2.17 ±0.37 (Group III), 2.38 ±0.49 (Group IV). Bone cells which are stained with osteocalcin were compared with slides with DiI staining. Transformation of adipose derived stem cells to bone cells were noted. In this study; We proved that negative effects of chronic renal disease on bone healing can be reduced by increasing mechanical, histological, radiological and biochemically with SVF and PRP treatments. Although thickness of callus tissue delays bone healing process, it also enhances biomechanical and organisation of bone tissue in long term. We conclude that stem cell therapies were effective for bone healing in animal models which can be promising for clinical trials.