Browsing by Author "Coşar, Begüm"

Filter results by typing the first few letters
Now showing 1 - 1 of 1
  • No Thumbnail Available
    Item
    Development of a pre-screening test for the Identification of extracellular vesicles associated with breast cancer
    (Başkent Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 2025) Coşar, Begüm
    Breast cancer (BC) is the most common malignancy among women and represents a significant public health concern due to its high incidence and mortality rates. Although early diagnosis is critical for survival, most cases are not detected at the early asymptomatic stage. This underscores the need for rapid, low-cost, and field-applicable diagnostic methods. Tumor-derived extracellular vesicles (EVs), carrying proteins, nucleic acids, and lipids, are promising biomarkers for liquid biopsy (LB)-based diagnostics. Both antibodies and aptamers serve as specific recognition elements for EV detection. The aim of this thesis is to obtain a protein-based lateral flow assay (LFA) assay to be used for pre-screening screening for the detection of BC-associated EVs and comparison of aptamer-based LFA and antibody-based LFA systems. In this study, isolated EVs were characterized using transmission electron microscopy (TEM), flow cytometry, and quantitative methods. As a result of the quantitation, it was observed that the amount of EV (particles/mL) obtained from the plasma of BC patients was 123.3-793.3 times higher than the amount of EV obtained from the plasma of healthy volunteers. With this, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) expression, which was selected as a BC-related EV biomarker, was found to be 41.75-67.45 times higher in EVs obtained from plasma of BC patients compared to EVs obtained from plasma of healthy volunteers Optimization determined the following conditions for the aptamer-LFA: 25 pM thiolated aptamer for conjugation; streptavidin (SA)-biotin aptamer at a ratio of 1:10 for the test (T) and 1:4 for the control (C) lines; streptavidin (SA) concentrations of 0.4 mg/mL (T) and 0.2 mg/mL (C); optimal EV concentration 1.825 *108 particles/mL; and plasma volume of 120 pL. For the antibody-based LFA, optimal conditions were: 15 pg primary antibody for conjugation; 1.5 pg (T) and 0.25 pg (C) antibody for immobilization; EV concentration 2.28*107 particles/mL; and plasma volume 60 pL. Subsequently, EV surface proteins CD63 and EpCAM were targeted with biorecognition elements for visualization using gold nanoparticles (AuNPs), resulting in a prototype pre- screening kit capable of delivering rapid results with minimal sample requirements. The findings demonstrate that the system provides a fast, portable, and non-invasive pre- screening tool for BC. A patent application has been filed with the Turkish Patent and Trademark Office for the developed product (Application No: 2023/005372). This protein- based LFA system offers an economical and field-applicable alternative for early screening and could be adapted for other cancer types using different biomarkers. Meme kanseri, kadınlarda en sık görülen malignite olup, yüksek insidans ve mortalite oranları ile önemli bir halk sağlığı sorunudur. Erken tanı sağkalım açısından kritik olmasına rağmen, vakaların çoğu asemptomatik seyreden erken evrede yakalanamamaktadır. Bu durum, hızlı, düşük maliyetli ve saha koşullarına uygun tanı yöntemlerini gerekli kılmaktadır. Tümör kaynaklı ekstrasellüler veziküller (EV’ler), içeriklerindeki protein, nükleik asitler ve lipitler sayesinde likit biyopsi tabanlı tanı için umut verici biyobelirteçlerdir. Hem antikorlar hem de aptamerler, EV tespitinde özgül tanıma elemanları olarak kullanılmaktadır. Bu tezin amacı meme kanseri ile ilişkili EV'lerin tespiti için ön tarama amaçlı kullanılacak protein tabanlı yanal akış tahlili (lateralflow assay; LFA) testinin elde edilmesi ve aptamer- tabanlı LFA ve antikor-tabanlı LFA sistemlerinin karşılaştırmasının yapılmasıdır. Bu çalışmada, izole edilen EV’ler TEM, akış sitometrisi ve kantitatif yöntemlerle karakterize edilmiştir. Yapılan kantitasyon sonucunda meme kanseri hastalarının plazmalarından elde edilen EV miktarı (partikül/mL) sağlıklı gönüllü plazmalarından elde edilen EV miktarına göre 123.3-793.3 kat fazla olduğu görülmüştür. Bununla birlikte, meme kanseri hastalarının plazmalarından elde edilen EV’lerde ve sağlıklı gönüllü plazmalarından elde edilen EV’lere göre meme kanseri ilişkili EV biyobelirteçi olarak seçilen epitel hücre yapışma molekülü (EpCAM) ekspresyonu 41,75-67,45 kat arasında daha fazla bulunmuştur. Optimizasyon sonucunda aptamer-tabanlı LFA için koşullar; konjugasyon için 25 pM tiyollü aptamer, test (T) için 1:10 ve kontrol (C) çizgileri için 1:4 oranında streptavidin (SA)- biyotinli aptamer, immobilizasyon için test çizgisinde 0,4 mg/mL SA ve kontrol çizgisinde 0,2 mg/mL SA olarak belirlenmiştir. Kartuşa yüklenecek optimal EV konsantrasyonu 1,825x108 partikül/mL ve optimal plazma hacmi ise 120 pL’dir. Antikor-tabanlı LFA için ise optimal koşullar; konjugasyon için 15 pg primer antikor, immobilizasyon için test çizgisinde 1.5 pg ve kontrol çizgisinde 0,25 pg antikor olarak belirlenmiştir. Kartuşa yüklenecek optimal EV konsantrasyonu 2,28 *107 partikül/mL ve optimal plazma ise hacmi 60 pL’dir. Ardından, EV yüzeyindeki CD63 ve EpCAM proteinlerini hedefleyen biyotanıma elemanlarıyla altın nanoparçacıkları (AuNP) tabanlı görselleştirme yapılmış ve minimal örnekle hızlı sonuç veren bir ön tarama testi prototipi geliştirilmiştir. Bulgular, sistemin meme kanseri için hızlı, taşınabilir ve non-invaziv bir ön tarama aracı sunduğunu göstermektedir. Geliştirilen ürün için Türk Patent ve Marka Kurumu’na patent başvurusu yapılmıştır (Başvuru No: 2023/005372). Bu protein temelli LFA sistemi, ön tarama için kullanılabilecek ekonomik ve sahada uygulanabilir bir alternatif sunmaktadır. Tasarlanan ve kavram kanıtı gerçekleştirilen sistem farklı biyobelirteçlerle diğer kanser tiplerinde de uyarlanabilir.