Knock out of GSH2 gene and production of γ-GC in nicotiana benthamiana leaves with Cas9 Vector/Cell penetrating peptide complex

Abstract

Gama glutamat sistein (γ-GC), terapötik ve besin takviyesi potansiyeli olan bir bileşiktir, ancak mevcut üretim yöntemleri maliyetli ve verimsizdir. Bu tez, Nicotiana benthamiana bitki yapraklarında gen düzenleme teknikleri ile bu bileşiği daha verimli bir şekilde üretmeyi amaçlamaktadır. Bu yenilikçi yöntemin bitki ve sağlık biyoteknolojisi alanında önemli bir parametre olacağına inanılmaktadır. N. benthamiana bitkilerinde γ-GC üretimini artırmak için yeni bir teknik kullanılmıştır. İlk adımda, özel olarak tasarlanmış bir CRISPR/Cas9 vektörü (pKI1.1R) ve KLA-10 hücreye nüfuz eden peptitler (CPP) kullanılmıştır. Tasarlanan gRNA, CPP-pDNA kompleksi oluşturmak için KLA-10 peptidi ile birleştirildi ve CPP-pDNA kompleksi farklı N/P oranlarında N. benthamiana yapraklarına infiltre edildi. Bu aşamada Agrobacterium tabanlı transformasyon yöntemi de kullanılmış ve seçilen yöntemin etkinliği kontrol edilmiştir. Araştırmamızda, N/P:1'in üzerindeki oranların bitki yapraklarında nekroza neden olduğu tespit edilmiştir. Hem Agrobacterium tabanlı bitki transformasyon yönteminde hem de geliştirilen yöntemde glutatyon sentetaz 2 (GSH2) geninde istenen mutasyon tespit edilmiştir. Ancak moleküler analizler tüm sonuçların karışık profilde olduğunu göstermiş ve GSH miktarında önemli bir azalma gözlenmiştir.Gamma glutamate cysteine (γ-GC) is a compound with the potential for therapeutic and nutritional supplements, but current production methods are costly and inefficient. This thesis aims to produce this compound more efficiently by gene editing techniques in Nicotiana benthamiana plant leaves, This innovative method is believed to be an important parameter in the field of plant and health biotechnology. A novel technique was used to increase γ-GC production on N. benthamiana plants. In the first step, a specially designed CRISPR/Cas9 vector (pKI1.1R) and KLA-10 cell penetrating peptides (CPP) were used. The designed gRNA was combined with KLA-10 peptide to form a CPP-pDNA complex and the CPP-pDNA complex was infiltrated into N. benthamiana leaves at different N/P ratios. At this stage, the Agrobacterium-based transformation method was also used, and the efficiency of the selected method was checked. In our research, it was found that ratios above N/P:1 caused a necrosis in plant leaves. In both the Agrobacterium-based plant transformation method and the method developed, the desired mutation in the glutathione synthetase 2 (GSH2) gene was detected. However, molecular analyses showed that all results were mixed profile and a significant decrease in GSH amount was observed.