Enstitüler / Institutes
Permanent URI for this communityhttps://hdl.handle.net/11727/1390
Browse
2 results
Search Results
Item Pseudomonas aeruginosa Bakteriyofaj kokteyli hazırlanması ve fare yanık yara enfeksiyon modelinde tedavideki etkinliğinin değerlendirilmesi(Başkent Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 2024) Ata Vural, Ilgın; Üsküdar Güçlü, AylinPseudomonas aeruginosa, birçok hastane enfeksiyonundan sorumlu kateterize veya yanık hastalarında ciddi, akut ve kronik enfeksiyonlara neden olan fırsatçı bir patojendir. P.aeruginosa'da patogeneze katkıları bulunan çeşitli virülans faktörleri tanımlanmıştır. P.aeruginosa günümüzde özellikle permeabilitedeki azalma, mutasyonlar, enzimatik inaktivasyon veya dış atım pompaları gibi mekanizmalarla çok sayıda antimikrobiyal ajana dirençli duruma gelmiş ve tedavideki güçlükler nedeniyle yeni teröpatik ajanlara ihtiyaç duyulmaktadır. Bakteriyofajlar (faj) da, çok ilaca dirençli bakteriyel enfeksiyonların tedavisi için potansiyel bir terapötik adaydır. Bu çalışmada atık su, nehir ve göl gibi çeşitli su kaynaklarından, P.aeruginosa izolatlarına etkili faj izole etmek ve bu fajların klinik izolatlardaki etkinlik spektrumunu araştırmak, fajları karakterize etmek ve in vivo olarak da etkinliğini test etmek amaçlanmıştır. Faj izolasyonu için çeşitli su kaynaklarından periyodik olarak su örneği alınmıştır. İzole edilen fajlar zenginleştirilip saflaştırılmış ve etki spektrumları P.aeruginosa klinik izolatlarında araştırılmıştır. İn vivo çalışmalar için PAO1 suşuna en etkili litik aktiviteye sahip olan fajlar seçilmiştir. Fajların morfolojik yapılarının incelenmesi için transmisyon elektron mikroskop (TEM) görüntüsü alınmıştır. İzole edilen fajların konak aralığı analizi, farklı bakteri türleri üzerinde spot test ile belirlenmiştir. Etkin bulunan fajların tam genom analizleri yapılarak genomlarında virülans faktörlerini ve antibiyotik direnç kodlayan genleri taşımayan fajlar in vivo çalışmaya dahil edilmiştir. İn vitro testleri tamamlanan fajların 3 tanesiyle bir faj kokteyli oluşturulmuş ve in vivo etkinliği test edilmiştir. Bu amaçla fareler üzerinde total vücut yüzey alanının %10’unu kapsayacak şekilde yanık yarası oluşturulmuş, takiben ̴1.05x107 konsantrasyonunda hazırlanan P. aeruginosa PAO1 solüsyonundan 100 μl kullanılarak yanık yarasında subkutan yolla enfeksiyon oluşturulmuştur. Toplam 45 Balb/c türü fare 5 gruba ayrılmıştır(0.80 güç ve %95 güven düzeyinde tek yönlü varyans analizi G-Power ile belirlenmiştir). 1. Grup; yanık yarası oluşturulan ve enfeksiyon oluşturulmayan kontrol grubu (YK). 2. Grup; yanık yarası ve enfeksiyon oluşturulan tedavi almayan kontrol grubu (SHAM); 3. Grup; yanık yarası oluşturulan ve enfeksiyon oluşturulmayan, faj kokteyli uygulanan toksisite kontrol grubu (YF); 4.Grup yanık yarası ve enfeksiyon oluşturulan, faj kokteyli tedavisi alan (YEF); 5. grup; yanık yarası ve enfeksiyon oluşturulan, antibiyotik (sefepim) tedavisi alan grup (YEA). Enfeksiyona ait parametrelerin takibi için tüm gruplarda 3 ve 7. günlerde kalp kanı alınarak CRP bakılmıştır. Ayrıca, 3. ve 7.günlerde her gruptan sırasıyla 4 ve 5 adet hayvan olmak üzere sakrifiye edilerek kan ve doku örneği alınmıştır. Doku örneklerinde hem kantitatif kültür yöntemiyle bakteri yükü hesaplanmış hem de histopatolojik inceleme yapılarak enflamatuar süreç incelenmiştir. Ayrıca her gün doku iyileşmesinin takibi için yara yüzeyi ölçülerek % yara kapanma oranı hesaplanmış ve dijital fotoğraf makinesi ile kaydedilmiştir. Deney sonunda sağ kalım yüzdeleri de hesaplanarak grup içinde ve gruplar arasında karşılaştırılmıştır. Çalışmada incelenen 5 gruba ait tanımlayıcı istatistikler ve dağılım değerleri değerlendirildikten sonra histopatoloji, CRP ve bakteriyel yük grup SHAM, grup YEF ve grup YEA grupları arasında nonparametrik testler ile değerlendirilmiştir. Histopatolojik bulguların değerlendirilmesinde kruskal wallis testi, CRP ve bakteriyel yüklerin değerlendirilmesinde ise friedman testinden faydalanılmıştır. Çalışmamızda PAO1 suşuna etkili 3 adet litik faj izole edilmiştir. Bu fajların Tam genom dizilerinin sonuçlarına göre yapılan biyoinformatik analizlerle yeni fajlar oldukları belirlenmiştir. Fajlar isimlendirildikten sonra GenBank’a yüklenmiştir. Faj kokteylinin in vivo etkinliği değerlendirilmiştir. Histopatolojik incelemelerde SHAM, YEF ve YEA grupları arasında istatiksel olarak herhangi bir farklılık tespit edilememiştir (p=0,2687; KW=2,808). CRP bakımından SHAM, YEF ve YEA grupları arasında istatiksel olarak herhangi bir farklılık tespit edilememiştir (p=0,5000; 𝑋𝑟2= 3,00). Tüm gruplar bakımından 3. ve 7. günlerde CRP değerleri kıyaslandığında ise gruplar arasında istatiksel olarak bir farklılık elde edilmiştir (p=0,0417; 𝑋𝑟2 = 7,600). Gruplar arasındaki farklılık özellikle YK ve SHAM grupları arasında gözlenmiştir. SHAM, YEF ve YEA grupları arasında 3. ve 7. gün bakteri yükü bakımından farlılık elde edilmiştir (p=0,0093; 𝑋𝑟2 = 7,60). Özellikle SHAM ve YEF grupları arasındaki farklılık önemli bulunmuştur(p=0,0354). Çalışmamızda elde ettiğimiz faj kokteyli, antibiyotik tedavisine bir alternatif olabileceğinden klinik çalışmalara öncü niteliği taşımaktadır. Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible for serious, acute, and chronic infections in catheterized or burn patients, contributing to numerous hospital-acquired infections. Various virulence factors have been identified that contribute to the pathogenesis of P. aeruginosa. Nowadays, P. aeruginosa has become resistant to many antimicrobial agents through mechanisms such as decreased permeability, mutations, enzymatic inactivation, or efflux pumps, necessitating new therapeutic agents due to treatment difficulties. Bacteriophages (phages) are potential therapeutic candidates for the treatment of multidrug-resistant bacterial infections. This study aims to isolate phages effective against P. aeruginosa isolates from various water sources such as wastewater, rivers, and lakes, investigate their efficacy spectrum on clinical isolates, characterize the phages, and test their in vivo efficacy. Water samples were periodically collected from various water sources for phage isolation. The isolated phages were enriched, purified, and their efficacy spectrum was investigated on P. aeruginosa clinical isolates. Phages with the most effective lytic activity against the PAO1 strain were selected for in vivo studies. Transmission electron microscopy (TEM) was used to examine the morphological structures of the phages. The host range analysis of the isolated phages was determined using spot tests on different bacterial species. Phages that did not carry virulence factors or antibiotic resistance genes in their genomes, as determined by complete genome analysis, were included in the in vivo study. A phage cocktail was prepared with three phages that completed in vitro tests and its in vivo efficacy was tested. For this purpose, burn wounds covering 10% of the total body surface area were created on mice, followed by subcutaneous infection of the burn wound with 100 μl of P. aeruginosa PAO1 solution prepared at a concentration of ̴1.05x10⁷. A total of 45 Balb/c mice were divided into 5 groups (determined by one-way analysis of variance with 0.80 power and 95% confidence level using G-Power). Group 1: control group with burn wound and no infection (YK). Group 2: control group with burn wound and infection but no treatment (SHAM). Group 3: toxicity control group with burn wound, no infection, and phage cocktail application (YF). Group 4: treatment group with burn wound, infection, and phage cocktail therapy (YEF). Group 5: treatment group with burn wound, infection, and antibiotic (cefepime) therapy (YEA). To monitor infection parameters, CRP was measured from heart blood samples taken on days 3 and 7 in all groups. Additionally, on days 3 and 7, 4 and 5 animals from each group were sacrificed respectively, and blood and tissue samples were taken. The bacterial load in tissue samples was calculated using quantitative culture methods and the inflammatory process was examined histopathologically. Furthermore, wound surface area was measured daily to calculate the percentage of wound closure and recorded with a digital camera. Survival rates were calculated at the end of the experiment and compared within and between groups. After evaluating the descriptive statistics and distribution values of the five groups examined in the study, histopathology, CRP, and bacterial load were assessed between the SHAM, YEF, and YEA groups using non-parametric tests. The Kruskal-Wallis test was used for the evaluation of histopathological findings, while the Friedman test was employed for the assessment of CRP and bacterial loads. In our study, three lytic phages effective against the PAO1 strain were isolated. Bioinformatic analyses based on the complete genome sequences of these phages revealed that they are novel. After being named, the phages were uploaded to GenBank. The in vivo efficacy of the phage cocktail was evaluated. Histopathological examinations showed no statistical differences between the SHAM, YEF, and YEA groups (p=0.2687; KW=2.808). Regarding CRP levels, no statistical differences were found between the SHAM, YEF, and YEA groups (p=0.5000; 𝑋𝑟2= 3.00). However, when comparing the CRP values on days 3 and 7 across all groups, a significant difference was observed (p=0.0417; 𝑋𝑟2 = 7.600). This difference was particularly noted between the YK and SHAM groups. A difference in bacterial load was also observed between the SHAM, YEF, and YEA groups on days 3 and 7 (p=0.0093; 𝑋𝑟2 = 7.60), with a significant difference especially noted between the SHAM and YEF groups (p=0.0354). The phage cocktail obtained in our study holds potential as an alternative to antibiotic treatment, thus serving as a precursor to clinical studies.Item Over kanseri hücrelerinde DNA hasarı ve golgi stresine yanıtta apoptotik mekanizmaların araştırılması(Başkent Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 2024) Aka, Yeliz; Ataç, F. BelginOver kanseri, metastatik aşamada tanı konması ve gelişen kemoterapi direnci nedeniyle tüm jinekolojik kanserler arasında mortalite oranı en yüksek olan kanser türüdür. Tümörün cerrahi olarak çıkarılmasına ve platin bazlı kemoterapiye rağmen, birçok over kanseri hastası kanser tekrarlaması nedeniyle hastalığa yenik düşmektedir. Bu nedenle, over kanseri hastalarının prognozunu iyileştirmek için yeni tedavi stratejileri esastır. Replikasyon stresi over kanserinin yaygın bir özelliğidir ve ATR/CHK1 sinyallemesi hücreleri replikasyon stresine karşı korumada öncelikli olarak rol oynar. ATR inhibitörünün tekil uygulamaları olmakla birlikte kombine tedavi uygulamalar da spesifik hedefler olarak etkinlik gösterirler. Over kanserlerinde ATR inhibitörleri birçok çalışmada kombine olarak mitokondriyal hücre ölüm yolaklarını aktive etse de çalışmalar kısıtlı kalmaktadır. Bu tez çalışmasıyla over kanseri hücrelerinde etkinlik gösterebilecek yeni bir moleküler kombinasyon tedavisinin, hem de bu kombinatoryal uygulamanın moleküler çalışma mekanizmalarının bulunması hedeflenmiştir. Yüksek verimli küçük molekül tarama analizini kullanarak, over kanseri hücrelerinde en etkili hücre ölümü indükleyen kombinasyon olarak AZD6738 (ATR inhibitörü) /Brefeldin A (Golgi stres indükleyicisi) belirlenmiştir. Deneysel çalışmalar ile AZD6738/Brefeldin A'nın eş zamanlı uygulanması, SKOV3 (***p<0.001, kontrol vs AZD6738+BFA) ve IGROV1 (**p<0.01, kontrol vs AZD6738+BFA) over kanseri hücrelerinde kaspaz-3 ve kaspaz-9 aktivasyonu ile apoptotik hücre ölümüne neden olmaktadır. AZD6738/Brefeldin A maruziyeti ayrıca sitozole sitokrom c translokasyonunu da indükler; bu, mitokondriyal hücre ölüm yolunun karakteristik bir özelliğidir. Buradaki en önemli moleküler süreç, SKOV3 ve IGROV1 hücrelerinde AZD6738/Brefeldin A'nın kombinatoryal kullanımı, anti-apoptotik BCL-2 ailesi üyeleri BCL-2, BCL-XL ve MCL1'in ifade seviyelerinde azalmaya yol açarken, özellikle BIM ve PUMA olmak üzere pro-apoptotik BCL-2 proteinlerinin ifade seviyelerinde artışa neden olur. Tüm bu bulgular, AZD6738/Brefeldin A'nın over kanseri için potansiyel bir tedavi yaklaşımı olduğunu düşündürmektedir. Ovarian cancer has the highest mortality rate among all gynecologic cancers due to its diagnosis at the metastatic stage and developing chemotherapy resistance. Despite surgical removal of the tumor and platinum-based chemotherapy, many ovarian cancer patients succumb to the disease due to cancer recurrence. Therefore, new treatment strategies are essential to improve the prognosis of ovarian cancer patients. Replication stress is a common feature of ovarian cancer, and ATR/CHK1 signaling plays a primary role in protecting cells from replication stress. Although ATR inhibitors have single applications, combination therapeutic applications also show efficacy as specific targets. Although ATR inhibitors activate mitochondrial cell death pathways in combination in many studies in ovarian cancer, studies remain limited. This thesis study aimed to find a new molecular combination therapy that could be effective in ovarian cancer cells, as well as the molecular working mechanisms of this combinatorial application. Using high-throughput small molecule screening analysis, AZD6738 (ATR inhibitor)/Brefeldin A (Golgi stress inducer) was determined as the most effective cell deathinducing combination in ovarian cancer cells. Experimental studies have shown that simultaneous application of AZD6738/Brefeldin A causes apoptotic cell death in SKOV3 (***p<0.001, control vs AZD6738+BFA) and IGROV1 (**p<0.01, control vs AZD6738+BFA) ovarian cancer cells, together with caspase-3 and caspase-9 activation. AZD6738/Brefeldin A exposure also induces cytochrome c translocation to the cytosol, which is a characteristic feature of the mitochondrial cell death pathway. The most important molecular process here is that the combinatorial use of AZD6738/Brefeldin A in SKOV3 and IGROV1 cells leads to a decrease in the expression levels of anti-apoptotic BCL-2 family members BCL-2, BCL-XL and MCL1, while it leads to an increase in the expression levels of pro-apoptotic BCL-2 proteins, especially BIM and PUMA. All these findings suggest that AZD6738/Brefeldin A is a potential therapeutic approach for ovarian cancer.