Su kaynaklarından karbapenem dirençli acinetobacter baumannii izolatlarına etkili bakteriyofaj izolasyonu ve karakterizasyonu

Abstract

Acinetobacter baumannii, birçok hastane enfeksiyonundan sorumlu Gram-negatif non-fermenter bir bakteriyel patojendir. A. baumannii keşfinden itibaren hem intrinsik mekanizmaları hemde kazanılmış direnç geliştirebilme yetenekleri nedeniyle birçok antibiyotiğe dirençli hale gelmiştir. Karbapenem dirençli A. baumannii (KDAB) suşlarının dünya çapında artan prevelansı, alternatif bir antimikrobiyal tedavi arayışına ve yeni terapötik stratejilerin gerekliliğini ortaya çıkarmıştır. Bakteriyofajlar (faj) da çoklu ilaç dirençli (ÇİD) bakterilerin neden olduğu enfeksiyonların tedavisi için umut verici adaylardır. Bu çalışmada atık su ve göl gibi çeşitli su kaynaklarından, KDAB izolatlarını enfekte eden faj izole etmek, bu fajların klinik izolatlardaki litik aktivitesini araştırmak ve izole edilen fajları karakterize etmek amaçlanmıştır. A. baumannii, Başkent Üniversitesi Ankara Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobioloji Laboratuvarında çeşitli klinik numunelerden izole edilmiştir. İzolatların karbapenem direnci disk difüzyon yöntemi ile saptanmıştır. Çalışmamızda, blaOXA-23, blaOXA-24 ve blaOXA ve kromozomal blaOXA-51 karbapenem direnç genleri polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi ile saptanmıştır. Klinik A. baumannii izolatları arasındaki klonal ilişki Pulsed-Field Jel Elektroforezi (PFGE) ile belirlenmiştir. Faj izolasyonu için çeşitli su kaynaklarından periyodik olarak su örneği alınmıştır. İzole edilen fajlar zenginleştirilip saflaştırıldıktan sonra litik aktiviteleri “spot test” ile belirlenmiştir. Fajların, “One-step growth” eğrileri “multiplicity of infection” (MOI) değerleri, ısı ve pH stabiliteleri değerlendirilmiştir. Fajların morfolojilerini ve taksonomik ailelerini belirlemek üzere transmisyon elektron mikroskop (TEM) görüntüleri alınmıştır. Fajların moleküler karakterizasyonu ve proteom analizleri için restriksiyon profilleri karşılaştırılmış ve Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-Page) uygulanmıştır. Klinik KDAB izolatlarının hepsinde kromozomal blaOXA-51 geni saptanırken, 73’ünde (n=73/96, %70) blaOXA-23, 12’sinde (n=12/96, %12.5) blaOXA-24 geni olduğu bulunmuştur. İzolatların hiçbirinde blaOXA-58 genine rastlanmamıştır. PFGE analizine göre izolatlar 1 major olmak üzere 5 pulsotipe ayrılmıştır. Klinik KDAB izolatlarına karşı litik aktivite gösteren dört A. baumannii fajı Başkent Üniversitesi Ankara Hastanesi atık suyu,Kütahya atık suyu, Kızılırmak ve Kırıkkale at harası atık suyundan izole edilmiştir. φAb65’nın latent periyodu 5 dk, φAb31 ve φAb69’nın 10 dk, φAb59’nın ise 15 dk olarak bulunmuştur. φAb31, φAb59, φAb65 ve φAb69’larının patlama boyutları ise sırasıyla, 3500, 1699, 2600 ve 118 PFU/CFU olarak hesaplanmıştır. Bütün fajların termal olarak stabil oldukları ve farklı pH aralıklarına toleranslı oldukları belirlenmiştir. TEM analizi sonucunda, fajlar, Myoviridae ailesine ait olarak teşhis edilmiştir. Restriksiyon analizi, bütün fajların birbirinden farklı restriksiyon profilinin olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada değerlendirilen fajların, daha ileri in vivo çalışmalar ve ÇİD bakterilerin tedavisinde terapötik bir ajan olarak kullanılmaya uygun olduğu ortaya konmuştur.Acinetobacter baumannii is a Gram-negative non-fermentative bacterial pathogen responsible for many hospital infections. Since its discovery, A. baumannii has become resistant to several antibiotics due to its intrinsic and acquired resistance mechanisms. The increasing prevalence of carbapenem-resistant A. baumannii (CRAB) has led to a search for alternative antimicrobial therapy and to the development of new therapeutic strategies. Bacteriophage (phage) therapy is a potential candidate for the treatment of multidrug-resistant (MDR) bacterial infections. In this study, it is aimed to isolate and characterize phages effective against CRAB from various water sources such as wastewater and lake and to investigate the lytic activity of these phages in clinical isolates. A. baumannii isolates were collected from different clinical specimens in Baskent University Ankara Hospital Infectious Diseases and Clinical Microbiology Laboratory. Carbapenem susceptibility was determined by disc diffusion method and Polymerase Chain Reaction (PCR) was used to detect blaOXA-23, blaOXA-24 and blaOXA-58 ve chromosomal blaOXA-51 carbapenem-resistance genes. The genetic relation between clinical A. baumannii isolates was determined by Pulsed-Field gel electrophoresis (PFGE). Water samples were taken periodically from various water sources for phage isolation. After the isolated phages were enriched and purified, their lytic activity was determined by a spot test. One-step growth curve, the multiplicity of infection (MOI), and thermal and pH stability of phages were evaluated. Transmission electron microscopy (TEM) was used to determine the morphologies and taxonomic families of phages. Restriction digestion and Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-Page) were applied for the molecular characterization and proteome analysis of phages. Chromosomal blaOXA-51 gene was detected in all of the clinical CRAB isolates, while blaOXA-23 was found in 73 of the isolates (n=73/96, 70%) and blaOXA-24 gene in 12 (=12/96, 12.5%). The blaOXA-58 gene was not detected in any of the isolates. PFGE revealed that the bacterial isolates were divided into 5 pulsotypes, including one major pulsotype. Four phages having lytic activity against CRAB A. baumannii were isolated from Baskent University Ankara Hospital wastewater, Kütahya wastewater, Kızılırmak and Kırıkkale horse stud wastewater. For φAb65, the latent period was 5 min, while for φAb31 and φAb69, it was 10 min. The latent period of φAb59 was 15 min. The burst size of φAb31, φAb59, φAb65 and φAb69 was 3500, 1699, 2600 and 118 PFU/CFU, respectively. All phages were thermally stable and tolerant to a wide pH range. TEM analysis revealed that phages belonged to Myoviridae family. Restriction analysis demonstrated that isolated phages had distinct digestion profiles. Evaluated phages in this study were found to be promising for further in vivo experiments and for usage as therapeutic agents to treat MDR bacterial infections.